Plošné hodnocení transformovaných linií

Cílem pokusu bylo základní zhodnocení morfologie co největšího počtu linií transformovaných modifikovaným genem pro NtHyPRP1 ve srovnání s širším okruhem kontrolních linií. Získaná metrická data měla prokázat existenci změněného fenotypu transformovaných linií a dokumentovat jeho četnost. V průběhu pokusu byly sebrány vzorky pro izolaci RNA a následnou semikvantitativní RT-PCR za účelem analýzy případné korelace mezi expresí transgenu a projevem fenotypu.
        Pro srovnání linií transformovaných modifikovaným genem pro NtHyPRP1 byly zvoleny dva okruhy kontrol, které byly použity i v další experimentální práci. Experiment byl založen roztřepáním kalusů do podoby suspenzních kultury. Kontrolou I byla výchozí netransformovaná buněčná linie BY-2. Pro účely pokusu byla suspenze BY-2 založena ve třech nezávislých baňkách, aby byla podchycena vnitřní variabilita materiálu (linie označeny 0a, 0b, 0c). Kontrolou II byly linie transformované genem kódujícím volné RS-GFP. O cytoplasmaticky lokalizovaném GFP se obecně soudí, že nepozměňuje významně fenotyp (morfotyp) rostlinného materiálu (Seth et Vierstra 1998 a přehled též viz Stewart 2001). Taková kontrola měla za cíl prokázat, že změna ve fenotypu "cílových" transformantů není důsledkem samotné transformace nebo kultivace na selekčním médiu.
        Kontrola I (BY-2) byla sice okamžitě k dispozici ve formě suspenze, ale i přesto byla suspenze nově založena z dlouhodobě kultivovaných kalusů, aby byl zajištěn shodný výchozí stav jako v případě transformovaných linií. Je totiž obecně známo, že fenotyp suspenzí rostlinných buněk se v průběhu kultivace mění a po založení suspenzní kultury z kalusu není fenotyp zdaleka tak vyrovnaný jako po mnohaměsíční kultivaci v tekutém médiu.
        Jako kontrola II bylo roztřepáno 9 linií transformovaných genem pro volné RS-GFP (označeny G1-G10, linie G3 pro špatný růst vyřazena). Transformantů nesoucích modifikovaný gen NtHyPRP1 bylo do experimentu zahrnuto 18 (označeny HD1-21, linie HD3, HD8 a HD16 pro špatný růst vyřazeny).
        Buněčné suspenze byly v rámci tohoto pokusu kultivovány podle standardního protokolu (viz kap. 3.2.1.1.) a jednotně umístěny na třepačkách IKA KS501 o poloměru třepání 35mm při nastavení 100 RPM. Před vlastním hodnocením byly kultury 3x subkultivovány (tj. 3 týdny kultivace), aby byly získány kvalitní "nehrudkující" suspenze.
        Během čtvrtého SBI bylo označení linií školitelem "randomizováno" a kódující klíč důkladně uschován, aby nemohlo být hodnocení linií subjektivně ovlivněno. Délka a šířka buněk byla hodnocena standardně (viz kap. 3.7.1.) ve 3. dni (exponenciální buňky) a 7. dni (stacionární buňky) subkultivačního intervalu. Vzorky RNA byly sbírány ve třetím dni.
        Získané výsledky jsou uvedeny formou tabulek, grafů a obrazové dokumentace v kap. 4.4.1.2. a 4.4.1.3.

Koukat na exponenciální buňky (3. den SBI)...

       

Koukat na stacionární buňky (7. den SBI)...


O úroveň výš...         Na hlavní stránku...